重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹
重組蛋白表達(dá)服務(wù)
原核蛋白表達(dá)服務(wù)
穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)
分離純化處于重組蛋白表達(dá)的下游處理（downstream processing）階段，且與上游過(guò)程緊密相聯(lián)，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)等。所以在對(duì)目的蛋白表達(dá)純化時(shí)，要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游對(duì)下游的影響。同時(shí)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過(guò)程：目的蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目的蛋白表達(dá)定位（胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和細(xì)胞外）
重組蛋白表達(dá)策略
表達(dá)策略優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)
分泌表達(dá)至細(xì)胞外 增強(qiáng)正確二硫鍵的形成
降低蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解
可獲得確定的N末端
顯著減少雜蛋白水平，簡(jiǎn)化純化
不需要細(xì)胞破碎 表達(dá)水平低
多數(shù)蛋白不能進(jìn)行分泌表達(dá)
表達(dá)蛋白需要濃縮 
細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá) 增強(qiáng)二硫鍵正確形成
可獲得確定N末端
顯著減少雜蛋白水平，簡(jiǎn)化純化 一些蛋白不能分泌進(jìn)入周質(zhì)空間
沒(méi)有大規(guī)模選擇性地釋放周質(zhì)空間蛋白的技術(shù)
周質(zhì)蛋白酶可引起重組蛋白的酶解 
細(xì)胞內(nèi)包涵體表達(dá) 包涵體易于分離
保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解 需要體外的折疊和溶解，得率較低
具有不確定N末端 
細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)不具有活性，對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有大影響
通?？色@得高表達(dá)水平
不需要體外溶解和折疊
一般具有正確的結(jié)構(gòu)和功能 高水平的表達(dá)難以得到
需要復(fù)雜的純化
可發(fā)生蛋白質(zhì)酶解
具有不確定N末端 
由上表可知選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可避免破碎細(xì)胞的步驟，而且細(xì)胞外和周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白種類較少，目的蛋白易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)重組蛋白時(shí)，重組蛋白通常是可溶性表達(dá)，但也易形成包涵體。可溶性蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離且純度較高，但回收具有生物活性的蛋白質(zhì)卻變得相當(dāng)困難，通常需要對(duì)聚集的蛋白進(jìn)行變，復(fù)性，而通常情況下活性蛋白的得率比較低。德泰生物憑借多年的蛋白表達(dá)服務(wù)操作經(jīng)驗(yàn)和相關(guān)的技術(shù)，可以提供可溶性重組蛋白保證型服務(wù)和更高純度的上清蛋白。
色譜法分離純化蛋白質(zhì)
色譜法又稱層析法，是利用不同物理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)。所有的色譜系統(tǒng)都由倆個(gè)相組成：固定相（固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上的成分）和流動(dòng)相（水和其他溶劑）。當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過(guò)固體相時(shí)，各組分與倆相發(fā)生相互作用（吸附，溶解，結(jié)合）并因作用力的不同導(dǎo)致流出時(shí)間上的差異，分部收集流出液，可以得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到分離各組分的目的。
色譜層析分離純化蛋白質(zhì)有多種方法，包括凝膠過(guò)濾色譜，離子交換色譜，親和色譜，疏水色譜液相色譜等。其中親和色譜在重組蛋白純化中的應(yīng)用廣泛。
分離純化原則總結(jié)：
應(yīng)盡可能利用蛋白質(zhì)不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同技術(shù)多次純化；
不同的蛋白在性質(zhì)上有很大區(qū)別，每一步純化步驟都應(yīng)當(dāng)充分利用目的蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)差異；
在純化早期階段要盡量減少處理體積，方便后續(xù)純化；
在純化后期階段，再使用造價(jià)高的純化方法，有利于純化材料的重復(fù)使用，減少再生復(fù)雜性。
親和色譜
親和色譜是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有的特異性親和力，從而達(dá)到分離的目的。即將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑并填充色譜柱，使得樣品混合物流經(jīng)色譜柱時(shí)，與親和配基能結(jié)合的物質(zhì)就被選擇性地吸附下來(lái)，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當(dāng)?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。
親和色譜具有高選擇性，高分辨率和高容量的特點(diǎn)，并且親和色譜純化過(guò)程簡(jiǎn)單，迅速，且分離效率高。并且可用于純化生物大分子、稀溶液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白的貯藏、從純化分子中除去殘余污染物等。但其需要針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求穩(wěn)定色譜的條件，且成本較高。（查看完整親和色譜純化方法介紹）
實(shí)驗(yàn)案例（從E.coli 中提取誘導(dǎo)表達(dá)的GST 標(biāo)簽融合蛋白）
案例簡(jiǎn)介
谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）親和標(biāo)簽是純化重組蛋白的常用方法，該方法以GST 能夠偶聯(lián)在介質(zhì)上的谷胱甘肽配體結(jié)合為基礎(chǔ)。同時(shí)，帶有GST 的蛋白與配體結(jié)合是可逆的，能夠在溫和，非變性的條件下通過(guò)加入還原型谷胱甘肽被洗脫下來(lái)。
實(shí)驗(yàn)材料
BL21 感受態(tài)細(xì)胞、PGEX 表達(dá)載體、LB 培養(yǎng)基、Amp（氨芐青霉素）、IPTG、蛋白酶控制劑、緩沖液1（100mmol/L Tris，PH 8.5，500mmol/L NaCl）、緩沖液2（100mmol/L NaAc，PH 4.5，500mmol/L NaCl）、PBS 緩沖液（100mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4）、洗脫緩沖液（50mmol/L Tris，PH 8.0,10mmol/L GSH）、微量紫外分光光度計(jì)、超聲波破碎儀、高速冷凍離心機(jī)、GST 柱。

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